Ludzki mózg dojrzewa latami

Rozwój ludzkiego mózgu rozciąga się na dwie dekady i właśnie dlatego jest tak trudny do badania — najciekawszych etapów nie da się podejrzeć wewnątrz żywego człowieka, a mysz dojrzewa nieporównywalnie szybciej. Zespół Paoli Arlotty z Harvard University i Broad Institute utrzymał organoidy ludzkiej kory mózgowej przez ponad pięć lat i sprawdził, czy tkanka tylko przeżywa, czy naprawdę wciąż się rozwija. Okazało się, że komórki przez cały ten czas przesuwały swój program rozwojowy do przodu, zapisywały upływ lat w epigenomie — a niektóre zachowały coś w rodzaju pamięci przebytej drogi.

Mózg dojrzewa w tempie niemal absurdalnie wolnym jak na standardy innych narządów i innych gatunków. Jego rozwój nie kończy się wraz z narodzinami ani kilka miesięcy później. Przebudowa połączeń, dojrzewanie komórek, mielinizacja i zmiany w regulacji genów trwają latami, a część struktur osiąga pełną dojrzałość dopiero po kilkunastu czy nawet dwudziestu latach życia.

Ta skala czasowa jest ogromnym problemem dla nauki. Kluczowych etapów rozwoju ludzkiego mózgu nie można obserwować eksperymentalnie w żyjącym człowieku, a modele zwierzęce nie odtwarzają charakterystycznego dla naszego gatunku, wyjątkowo powolnego rytmu dojrzewania układu nerwowego.

Organoid mózgowy nie jest „mózgiem w słoiku”

Jednym z obejść tego problemu są organoidy mózgowe — niewielkie, trójwymiarowe struktury hodowane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Odpowiednio dobrane warunki hodowli i sygnały chemiczne kierują te komórki w stronę rozwoju nerwowego. Zaczynają się namnażać, różnicować i samoorganizować w strukturę zawierającą między innymi progenitory neuronalne, neurony, astrocyty i inne komórki typowe dla rozwijającej się kory.

Powstaje coś eksperymentalnie bezcennego: fragment tkanki zachowujący część biologicznych reguł prawdziwego ludzkiego mózgu, który można obserwować, analizować i modyfikować w laboratorium.

Nie powstaje jednak mózg. Organoid nie ma czaszki, prawdziwego unaczynienia, pełnej anatomii układu nerwowego ani połączeń z oczami, uszami i mięśniami. Nie dostaje też strumienia doświadczeń zmysłowych, który od pierwszych chwil życia intensywnie kształtuje mózg człowieka. Popularne określenie „miniaturowy mózg” jest chwytliwe, ale prowadzi na manowce — i nowe badanie niczego tu nie zmienia. Naukowcy analizowali dojrzewanie komórek, ekspresję genów, epigenetykę, budowę neuronów i ich aktywność elektryczną. To bardzo dużo, ale to nie jest świadomość ani myślenie.

Największym ograniczeniem tej technologii był dotąd czas

Organoidy są w badaniach od lat i zdążyły stać się ważnym narzędziem biologii rozwoju. Kłopot polegał na tym, że dobrze odtwarzały głównie wczesne etapy — mniej więcej to, co dzieje się w mózgu płodowym.

Dla wielu pytań to za mało. Jeśli chcemy badać procesy zachodzące w mózgu noworodka czy kilkulatka albo późne skutki zaburzeń powstających bardzo wcześnie, model zatrzymany na etapie prenatalnym niewiele powie.

Wcześniejsze eksperymenty sięgały około dwóch lat, ale długie hodowle wiązały się z utratą kolejnych populacji neuronów. Neurony są komórkami wymagającymi: potrzebują odpowiedniego środowiska metabolicznego, składników odżywczych, aktywności i warunków pozwalających tworzyć oraz utrzymywać synapsy.

Zespół Arlotty zadał więc pytanie podstawowe: co się stanie, jeśli pozwolimy organoidowi rozwijać się nie przez kilka miesięcy, lecz przez kilka lat?

110 organoidów, 424 720 komórek, 16 punktów czasowych

Badacze wyhodowali organoidy odwzorowujące rozwój ludzkiej kory i część z nich utrzymywali w laboratorium ponad pięć lat. Materiał pobierali kolejno — po sześciu i dziewięciu miesiącach, po roku, półtora, dwóch, trzech, czterech i pięciu latach — a następnie poddawali go szczegółowej analizie na poziomie pojedynczych komórek.

Łącznie zestaw danych objął 110 organoidów i 424 720 komórek w 16 punktach czasowych, od około 15 dni hodowli do pięciu lat.

Nie chodziło więc o stwierdzenie pod mikroskopem, że „kawałek tkanki nadal żyje”. Można było sprawdzić, jakie typy komórek występują w organoidach, które geny są w nich aktywne, jak z upływem lat zmienia się epigenom i czy przypomina to przebieg rozwoju prawdziwego mózgu.

Komórki zachowywały się tak, jakby wiedziały, ile mają lat

Pierwszy mocny wynik przyniosła analiza ekspresji genów. Naukowcy zestawili programy aktywności genów w organoidach z dużymi zbiorami danych z prawdziwej ludzkiej kory — rozwijającej się przed narodzinami i po nich. Powstał w ten sposób molekularny kalendarz.

Najmłodsze organoidy, od 15 dni do dwóch miesięcy, przypominały transkrypcyjnie tkankę mózgu z pierwszego trymestru ciąży. Trzy- i sześciomiesięczne przesuwały się w stronę profilu drugiego trymestru. Po dziewięciu miesiącach i w kolejnych latach zaczynały pojawiać się wzorce charakterystyczne dla późnego okresu prenatalnego, a po mniej więcej roku hodowli — wyraźne sygnały rozwoju postnatalnego.

To jeden z najważniejszych rezultatów całej pracy. Komórki nie wykonały kilku pierwszych kroków rozwoju i nie utknęły w nich na zawsze. Ich program biologiczny przesuwał się dalej wraz z rzeczywistym upływem miesięcy i lat.

Biologiczny czas mierzą nie wskazówki, lecz metylacja DNA

Czym właściwie jest „wiek” pojedynczej komórki, skoro komórka nie ma ani kalendarza, ani zegarka? Zapisuje go wiele nakładających się procesów: aktywność genów, działanie regulatorowych elementów DNA, metabolizm, budowa komórki, liczba i charakter połączeń, wreszcie epigenom.

Epigenetyka jest tu szczególnie ciekawa. Sekwencja DNA pozostaje praktycznie ta sama, a mimo to zmienia się sposób, w jaki komórka z niej korzysta. Jednym z najważniejszych mechanizmów jest metylacja DNA — dołączanie grup metylowych do określonych miejsc cząsteczki, co wpływa na regulację genów. Wzór tych zmian bywa na tyle regularny, że pozwala budować zegary epigenetyczne: algorytmy szacujące wiek tkanki na podstawie metylacji w wybranych miejscach genomu.

Badacze postanowili więc zapytać DNA organoidów, ile jego zdaniem trwa hodowla.

Zegar epigenetyczny trafił niemal w rzeczywisty czas hodowli

Analizę metylacji całego genomu wykonano dla dziewięciu etapów rozwoju, od trzech miesięcy do pięciu lat, po czym zastosowano kilka znanych modeli — w tym ogólnoustrojowy zegar Horvatha i zegar zaprojektowany specjalnie dla ludzkiej kory mózgowej.

Wiek przewidywany na podstawie metylacji okazał się silnie skorelowany z rzeczywistym czasem spędzonym w inkubatorze. W dwóch głównych modelach współczynnik korelacji sięgał 0,88–0,90. Innymi słowy: gdyby algorytmowi nie powiedzieć, czy tkanka hodowana była kilka miesięcy, czy kilka lat, sam wzór zmian epigenetycznych w dużej mierze by to zdradził.

Nie był to przy tym prosty efekt wielokrotnych podziałów komórkowych. Dodatkowe analizy wskazały, że sygnał odpowiada przede wszystkim programom dojrzewania, a nie samej historii proliferacji.

Porównując organoidy trzymiesięczne z pięcioletnimi, badacze wskazali ponad 200 regionów DNA, w których poziom metylacji zmieniał się z wiekiem — wśród nich obszary związane z genami ważnymi dla rozwoju kory. Rósł też udział szczególnego rodzaju metylacji, oznaczanego jako mCA, uznawanego za jeden z molekularnych znaków dojrzewania neuronów po narodzinach. Zmieniały się więc nie pojedyncze geny, lecz cały system regulowania genomu.

Nie wszystkim komórkom udawało się przetrwać równie dobrze

Tu ujawniło się jedno z największych ograniczeń modelu. Astrocyty i część populacji glejowych trzymały się przez lata nieźle i nabierały coraz bardziej dojrzałych cech; widoczne były nawet ślady postępującej mielinizacji, czyli otaczania wypustek neuronów osłonką przyspieszającą przewodzenie impulsów.

Z neuronami było gorzej. W standardowym podłożu hodowlanym ich udział systematycznie malał wraz z wiekiem organoidu. Nie znikały jednak wszystkie — metodami pozwalającymi analizować nienaruszoną tkankę odnajdywano komórki z markerami neuronalnymi po dwóch, trzech, czterech, pięciu, a nawet około 5,8 roku hodowli.

Wynik imponujący, ale i pouczający: utrzymać komórki przy życiu przez kilka lat to jedno, a zachować sprawnie działającą sieć neuronów — coś znacznie trudniejszego.

Zmiana „diety” obudziła neurony

Punktem wyjścia była obserwacja, że aktywność elektryczna neuronu nie jest wyłącznie skutkiem jego funkcjonowania — sama pomaga mu dojrzewać i przetrwać. Standardowe pożywki do długich hodowli nie sprzyjały silnej spontanicznej aktywności, zespół sięgnął więc po podłoże oparte na preparacie BrainPhys, wzbogacone o składniki wspierające pracę neuronów. Nazwano je activity-permissive medium (APM), czyli podłożem pozwalającym na aktywność.

Efekt był wyraźny. W dziewięciomiesięcznych organoidach hodowanych w APM było znacznie więcej aktywnych neuronów projekcyjnych niż w warunkach standardowych, a same komórki miały bogatszą morfologię: dłuższe wypustki i bardziej złożone rozgałęzienia. Po roku rosła też gęstość synaps oraz struktur przypominających kolce dendrytyczne — mikroskopijne wypustki, na których powstaje wiele połączeń synaptycznych.

Neurony zaczęły pracować jak sieć

Obecność neuronów i synaps nie oznacza jeszcze, że komórki działają wspólnie. Naukowcy sięgnęli więc po trójwymiarowe matryce mikroelektrod, rejestrujące sygnały elektryczne wewnątrz organoidów mających sześć, dziewięć i dwanaście miesięcy.

Spontaniczne wyładowania pojawiały się w obu typach hodowli, ale organoidy trzymane od wczesnego etapu w APM radziły sobie wyraźnie lepiej: generowały więcej impulsów i częściej wchodziły w skoordynowane epizody aktywności obejmujące większe grupy neuronów, określane jako network bursts.

Po roku różnica stała się rozstrzygająca. Żaden z ośmiu analizowanych organoidów hodowanych standardowo nie wykazywał już skoordynowanych wyładowań sieciowych, podczas gdy wszystkie dziewięć rocznych organoidów z APM nadal utrzymywało silną aktywność sieciową. Testy farmakologiczne potwierdziły, że rejestrowane sygnały wiążą się z działaniem synaps glutaminianergicznych — nie był to więc szum aparatury.

Pomiary powtórzone po dwóch latach nadal wykazywały aktywne wyładowania i skoordynowaną pracę sieci. Zmieniła się jednak jej struktura: w młodszych organoidach bardzo duża część neuronów wyładowywała się jednocześnie i podobnie, a w dwuletnich dało się już wyróżnić co najmniej dwie grupy komórek o własnych wzorcach wspólnej aktywacji. To wciąż nie jest mózg zdolny do myślenia — ale to dowód, że w odpowiednich warunkach laboratoryjna tkanka nerwowa potrafi przez lata utrzymywać funkcjonalne połączenia, a jej dynamika staje się z czasem bardziej złożona.

Najdziwniejszy eksperyment: stare komórki w młodym otoczeniu

Utrzymanie organoidów przy życiu przez pięć lat było osiągnięciem technicznym. Pokazanie, że ich epigenom odmierza czas — biologicznym. Najbardziej intrygująca część pracy dotyczyła jednak czegoś innego: czy komórka tylko wygląda na starszą, czy naprawdę pamięta etap rozwoju, przez który już przeszła.

Aby to sprawdzić, badacze zbudowali organoidy chimeryczne, nazywane w pracy chimeroidami. Pobrali komórki progenitorowe ze stosunkowo starych organoidów, mających dziewięć do dwunastu miesięcy, i połączyli je z komórkami z bardzo młodych, mniej więcej piętnastodniowych struktur. Obok siebie znalazły się komórki tego samego rodzaju rozwijającej się tkanki, ale o zupełnie różnej historii czasowej.

Młode komórki wysyłały sygnały typowe dla najwcześniejszych etapów rozwoju, a starsze progenitory potrafiły je odebrać i na nie zareagować. Można było się więc spodziewać, że zostaną cofnięte i przejdą całą sekwencję rozwojową od nowa.

Nic takiego nie nastąpiło. Starsze progenitory rzeczywiście wznowiły produkcję neuronów, ale pominęły etapy, które z punktu widzenia ich własnej historii już się wydarzyły. Podczas gdy komórki z młodego organoidu tworzyły populacje typowe dla wczesnego rozwoju, starsze przechodziły od razu do późniejszych typów neuronów i komórek glejowych — w około dwa tygodnie wytwarzając to, co w normalnym rozwoju organoidu wymaga kilku miesięcy.

To tak, jakby wyjąć komórkę z biologicznego kalendarza, otworzyć go na wcześniejszej stronie i odkryć, że ona nadal pamięta, które rozdziały już przeczytała.

Pamięć czasu rozwojowego

Autorzy nazywają to zjawisko temporal memory — pamięcią czasową. Nie chodzi rzecz jasna o pamięć w sensie neurologicznym; progenitor nie „wspomina” przeszłości tak jak człowiek. Chodzi o utrwalony stan regulacyjny, który mówi komórce, przez jakie fazy już przeszła i jakie typy komórek powinna teraz wytwarzać.

Eksperyment ujawnia przy tym dwie właściwości naraz. Starsze komórki zachowują plastyczność — potrafią zareagować na środowisko i wznowić neurogenezę. Ale plastyczność nie oznacza wymazania historii: wcześniejszy rozwój zostawił molekularny ślad, który współdecyduje o kolejnych krokach.

To może być jeden z kluczy do zrozumienia, dlaczego ludzki mózg wytwarza określone typy neuronów w tak precyzyjnej kolejności i dlaczego pewne możliwości rozwojowe otwierają się i zamykają w ściśle wyznaczonych momentach.

Skąd komórka wie, że minął rok?

To pytanie pozostaje otwarte i jest chyba najciekawszym problemem, jaki zostawia po sobie ta praca. Wiadomo, że na tempo dojrzewania wpływają mechanizmy epigenetyczne, metabolizm mitochondriów, regulacja ekspresji genów i wzajemne oddziaływania między komórkami. Nie znamy jednak jednego nadrzędnego „zegara mózgu”.

Najważniejsza wskazówka jest taka, że ludzki zegar rozwojowy wydaje się w znacznej części zapisany wewnątrz samych komórek. Skoro ludzkie neurony hodowane poza organizmem przez lata nie przyspieszają nagle do tempa mysiego, powolny rytm naszego rozwoju nie jest wyłącznie skutkiem środowiska ludzkiego ciała.

Ma to znaczenie szersze niż laboratoryjne. Wyjątkowo długie utrzymywanie cech młodzieńczych i powolne dojrzewanie określa się w biologii terminem neotenia, a ludzki mózg jest jego najbardziej spektakularnym przykładem. Kosztuje to sporo: dziecko przez lata pozostaje zależne od innych, a mózg pochłania ogromną ilość energii. W zamian dostajemy jednak bardzo długi okres, w którym doświadczenie — język, relacje społeczne, edukacja, ruch, napływ bodźców — może przebudowywać sieci neuronalne. Zrozumienie molekularnego mechanizmu tego spowolnienia powie więc coś nie tylko o chorobach mózgu, ale i o tym, co odróżnia rozwój naszego gatunku od innych ssaków.

Okno na okres, którego nauka niemal nie mogła badać

Tu leży największa praktyczna wartość pięcioletnich hodowli. Wczesny rozwój płodowy da się badać na materiale tkankowym i danych molekularnych. Dorosły mózg — obrazowaniem, badaniami neurofizjologicznymi i materiałem pobranym po śmierci. Pomiędzy tymi etapami rozciąga się jednak długi okres, zwłaszcza pierwsze lata po narodzinach, w którym zachodzą fundamentalne zmiany, a możliwości eksperymentalnego badania ludzkiej tkanki mózgowej są minimalne.

Jeśli organoid po roku, dwóch czy pięciu latach naprawdę odtwarza część programów coraz późniejszego rozwoju, naukowcy dostają na ten okres laboratoryjne okno.

Szczególnie wiele może to zmienić w badaniach nad zaburzeniami neurorozwojowymi. Wiele z nich ma źródła bardzo wczesne, a pełne objawy pojawiają się po miesiącach lub latach — mutacja może zmienić zachowanie progenitora jeszcze przed narodzinami, a skutkiem będzie nieprawidłowe dojrzewanie synaps widoczne dopiero znacznie później. Krótka hodowla takiego efektu w ogóle nie pokaże. Długowieczny organoid pozwala natomiast wprowadzić określoną zmianę genetyczną i obserwować model miesiącami, sprawdzając, w którym momencie trajektoria rozwoju zaczyna odbiegać od prawidłowej. National Institutes of Health wskazuje w tym kontekście między innymi na badania nad autyzmem i innymi zaburzeniami rozwoju układu nerwowego.

Nie powstał oczywiście model pozwalający „wyhodować autyzm w probówce” — zaburzenia mózgu zależą od genów, środowiska i całego organizmu. Zmienia się jednak rodzaj pytań, które można zadać. Dotąd liczyło się głównie to, co działa nieprawidłowo; teraz da się pytać, kiedy pojawiło się pierwsze odchylenie. Czy podczas powstawania neuronów, czy dopiero przy dojrzewaniu synaps? Czy gen działa poprawnie przez pierwszy rok, a konsekwencje ujawnia później? Czy defekt można skorygować wyłącznie w określonym oknie czasowym? Przy organoidach kilkumiesięcznych takie pytania były pozbawione sensu.

To wciąż model bardzo uproszczony

Spektakularny wynik nie powinien przesłaniać granic technologii. Organoid hodowany pięć lat nie staje się pięcioletnim ludzkim mózgiem.

Prawdziwy mózg dojrzewa w organizmie, który dostarcza mu sygnałów hormonalnych, metabolicznych i immunologicznych. Bez przerwy odbiera informacje ze zmysłów, steruje ruchem, reaguje na zachowanie innych ludzi i pozostaje częścią układu krążenia oraz całej fizjologii ciała. Organoid jest od większości tych sygnałów odcięty.

Sami autorzy wskazują, że kolejnym krokiem powinno być wprowadzanie do modeli czynników obecnych w naturalnym rozwoju — bardziej fizjologicznej aktywności wywoływanej bodźcami czy wpływu tkanek spoza układu nerwowego. Może się wtedy okazać, że część programów dojrzewania biegnie niemal samodzielnie, a inne bez informacji z ciała i środowiska po prostu nie ruszą.

Pięć lat to rekord — i wciąż dopiero początek

Kryje się w tym pewien paradoks. Pięć lat hodowli komórkowej to eksperyment ekstremalnie długi: obejmuje całe doktoraty, zmiany personelu, tysiące wymian pożywki i konieczność utrzymania tych samych kultur przez znaczną część czyjejś kariery naukowej. Dla ludzkiego mózgu pięć lat to natomiast wciąż wczesne dzieciństwo. Nasza kora dojrzewa znacznie dłużej — zmiany w ekspresji genów, epigenomie, mielinizacji i pracy sieci trwają przez całe dzieciństwo i okres dojrzewania.

Najciekawsze w tej pracy nie jest więc samo utrzymanie tkanki przy życiu, lecz to, co przez te pięć lat się w niej działo. Komórki przesuwały ekspresję genów zgodnie z kolejnymi etapami rozwoju. Ich DNA gromadziło zmiany epigenetyczne odzwierciedlające rzeczywisty upływ czasu. Neurony budowały coraz bardziej złożone kształty i połączenia, a w sprzyjających warunkach ich sieci pozostawały aktywne latami. A przeniesione w otoczenie pełne sygnałów młodości stare progenitory zareagowały na nie, nie zapominając przy tym, gdzie już były.

Pięcioletni organoid nie jest pięciolatkiem zamkniętym w probówce. Jest czymś naukowo o wiele ciekawszym: układem, w którym komórki ludzkiej kory przez lata realizują własny program rozwojowy i zostawiają w genomie zapis mijającego czasu. Największym osiągnięciem tej pracy nie jest zatem rekord długości hodowli, lecz możliwość obserwowania biologicznego czasu w działaniu.